Hoechst (краситель)

Химическая структура красителей Hoechst

Красители Hoechst принадлежат семейству синих флуоресцентных красителей, используемых для окрашивания ДНК[1][2]. Этот бис-бензимид, первоначально разработанный компанией Hoechst AG, получил номер 33342. Ему родственны красители Hoechst 33258 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342, применяющиеся чаще всего, имеют схожие спектры возбуждения-испускания.

Молекулярные характеристики

Спектры возбуждения-испускания красителей Hoechst

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом длиной волны около 350 нм, и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет вокруг максимума спектра излучения при 461 нм. Несвязанный краситель имеет максимальную эмиссию флуоресценции в диапазоне 510—540 нм. Молекулы красителя можно возбудить ксеноновой или ртутной дуговой лампой или ультрафиолетовым лазером. Благодаря значительному различию между спектрами возбуждения и испускания красители Hoechst часто применяются в экспериментах со многими несколькими флюорофорами. Интенсивность флуоресценции красителей Hoechst увеличивается с ростом pH раствора[3].

Красители Hoechst растворимы в воде и в органических растворителях, таких как диметилформамид или диметилсульфоксид . Могут быть достигнуты концентрации до 10 мг/мл. При хранении в защищённом от света месте при температуре 2-6 °C водные растворы красителя стабильны не менее шести месяцев. Для длительного хранения растворы замораживают при −20 °С или ниже[3].

Hoechst 33258 (пурпурный) связан с малой бороздкой ДНК (зеленый и синий). Из PDB 264D

Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК, чаще всего с последовательностями, богатыми аденином и тимином. Хотя красители могут связываться с любыми нуклеиновыми кислотами, двухцепочечные ДНК, богатые AT, значительно усиливают флуоресценцию[4]. Красители Hoechst проникают в клетки и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках . Таким образом, эти пятна часто называют суправитальными, что означает, что клетки не погибают при обработке этими соединениями. Клетки, экспрессирующие специфические АТФ-связывающие кассетные белки-транспортеры, также могут активно транспортировать эти пятна из своей цитоплазмы. 

Применение

Трансмиссионное изображение клеток HeLa с наложением окрашивания Hoechst 33258 (синий). Крайняя левая клетка находится в прометафазной стадии митоза; её хромосомы ярко флуоресцируют, потому что они содержат сильно уплотненную ДНК.
Флуоресцентное изображение культивируемых нейтрофилов, выделенных из венозной крови человека с болезнью Альцгеймера. Образец был обработан красителем Hoechst 33342, используемым для окрашивания ДНК. На снимке видно высвобождение ДНК нейтрофилом в виде туманной области в центре поля зрения, что указывает на спонтанную активацию образования нейтрофильных внеклеточных ловушек у больных БА, что обычно не наблюдается у здоровых людей.

Концентрация 0,1-12 мкг/мл обычно используется для окрашивания ДНК в клетках бактерий или эукариот. Клетки окрашивают в течение 1-30 мин при комнатной температуре или 37 °C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зелёная флуоресценция несвязанного красителя Hoechst может наблюдаться на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых[3] Красители Hoechst часто используются вместо другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI.

Основные различия между красителями Hoechst и DAPI:

  • Красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток[5].
  • Дополнительная этильная группа в некоторых красителях Hoechst (Hoechst 33342) облегчает их проникновение в клетки[6].
  • Существуют красители для окрашивания ядер, позволяющие клеткам жить после окрашивания. 

Hoechst 33342 и 33258 гасятся бромдезоксиуридином (BrdU), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 обладает в 10 раз большей проницаемостью для клеток, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве замены тимидина. Предполагается, что при интеграции BrdU в ДНК бром деформирует малую бороздку, из-за чего красители Hoechst не могут достичь своего оптимального сайта связывания. Хотя красители Hoechst связываются с BrdU-замещенной ДНК сильнее, чем с обычной, никакой флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга прогрессирования клеточного цикла[7][8].

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК для следующих целей:

Выделение Hoechst также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выделять краситель, их можно обнаружить с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции. Это делается путем пропускания флуоресценции, испускаемой возбужденным Hoechst, через красный и синий фильтры и нанесения красного и синего Hoechst друг на друга. 

Токсичность и безопасность

Поскольку красители Hoechst связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время клеточного деления. Следовательно, они являются потенциально мутагенными и канцерогенными, поэтому при обращении с ними и их утилизации следует соблюдать осторожность. Окрашивание красителями Hoechst используется для сортировки спермы у домашнего скота и людей. Его безопасность обсуждалась[13][14].

См. также

Примечания

  1. ↑ Latt, SA (July 1975). Recent developments in the detection of deoxyribonucleic acid synthesis by 33258 Hoechst fluorescence. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 23 (7): 493–505. doi:10.1177/23.7.1095650. PMID 1095650.
  2. ↑ Latt, SA (January 1976). Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 24 (1): 24–33. doi:10.1177/24.1.943439. PMID 943439.
  3. 1 2 3 Hoechst Stains. Invitrogren (Molecular Probes). Архивировано из оригинала 19 апреля 2009 года.
  4. ↑ Portugal, J (1988-02-28). Assignment of DNA binding sites for 4′,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 949 (2): 158–68. doi:10.1016/0167-4781(88)90079-6. PMID 2449244.
  5. ↑ BD Bioscience. Techniques for Immune Function Analysis. — 2. — Becton, Dickinson and Company, 2009. Архивная копия от 22 марта 2012 на Wayback Machine
  6. ↑ Bucevičius, Jonas (18 апреля 2018). The Use of Hoechst Dyes for DNA Staining and beyond. Chemosensors (англ.). 6 (2): 18. doi:10.3390/chemosensors6020018. ISSN 2227-9040. Архивировано 22 сентября 2022. Дата обращения: 16 сентября 2022.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) (ссылка)
  7. ↑ Kubbies, M (January 1983). Flow cytometric analysis of factors which influence the BrdUrd-Hoechst quenching effect in cultivated human fibroblasts and lymphocytes. Cytometry. 3 (4): 276–81. doi:10.1002/cyto.990030408. PMID 6185287.
  8. ↑ Breusegem, SY (2002-02-01). Base-sequence specificity of Hoechst 33258 and DAPI binding to five (A/T)4 DNA sites with kinetic evidence for more than one high-affinity Hoechst 33258-AATT complex. Journal of Molecular Biology. 315 (5): 1049–61. doi:10.1006/jmbi.2001.5301. PMID 11827475.
  9. ↑ Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. — Invitrogen, 2010-07-21. — ISBN 978-0-9829279-1-5.
  10. ↑ Kubbies, M (1990). Flow cytometric recognition of clastogen induced chromatin damage in G0/G1 lymphocytes by non-stoichiometric Hoechst fluorochrome binding. Cytometry. 11 (3): 386–94. doi:10.1002/cyto.990110309. PMID 1692786.
  11. 1 2 Mocharla, R (1987-12-23). A novel, sensitive fluorometric staining technique for the detection of DNA in RNA preparations. Nucleic Acids Research. 15 (24): 10589. doi:10.1093/nar/15.24.10589. PMID 2447564.
  12. ↑ Sterzel, W (June 1985). Automated determination of DNA using the fluorochrome Hoechst 33258. Analytical Biochemistry. 147 (2): 462–7. doi:10.1016/0003-2697(85)90299-4. PMID 2409841.
  13. ↑ Ashwood-Smith, M.J. (1994). Safety of human sperm selection by flow cytometry. Human Reproduction. 9 (5). Oxford University Press: 757–759. doi:10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589. PMID 7929716.
  14. ↑ Parrilla, I (2004). Hoechst 33342 stain and u.v. laser exposure do not induce genotoxic effects in flow-sorted boar spermatozoa. Reproduction. 128 (5): 615–621. doi:10.1530/rep.1.00288. PMID 15509707.

Ссылки

Эта статья взята у (из) Wikipedia. Текст лицензируется по Creative Commons - Attribution - Sharealike. К медиа файлам могут применятся дополнительные условия.